تم تنقية معظم سمومنا وتمييزها. في بعض الحالات ، قد يرغب المحققون الطبيون الآخرون في الحصول على جزء مُنقى معين. لتقديم هذه الخدمة ، سيتم تنقية السموم وتمييزها. سيتم استخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) لاستبعاد الحجم والتبادل الأيوني والمرحلة العكسية. يوفر HPLC طريقة مريحة وسريعة للغاية لعزل السموم. تُستخدم هذه الطريقة بشكل شائع في NNTRC وقد أثبتت نجاحها (Khunsap et al.، 2011؛ ​​Teklemariam et al.، 2011؛ ​​Suntravat et al.، 2010؛ Da Silva et al.، 2009؛ Salazar et al.، 2009؛ Sánchez et al.، 2009؛ 2006؛ 2005؛ Galán et al.، 2008، 2008، 2007، Génón.) سيتم عزل الجزيئات التي يمكن أن يكون لها تطبيقات طبية مثل المتفكّلات ، والكتينات من النوع C ، و PLA2s ، وسُم الأفعى ، والبروتينات المعدنية ، وسيرين بروتياز من A. piscivorus leucostoma ، و C. adamanteus ، و C. viridis viridis ، و C. horridus.

تعتمد الخطوات الكروماتوغرافية لتنقية الجزيئات من سموم الثعابين على خصائصها الفيزيائية والكيميائية. يتم استخدام هذه الأساليب بشكل روتيني في NNTRC. تتكون طريقة تنقية التفككات من مزيج من ثلاث خطوات كروماتوجرافية: المرحلة العكسية C18 (Vydac) ، واستبعاد الحجم ، وكروماتوجرافيا تبادل الأنيون (Sánchez et al. ، 2009 ؛ 2006 ؛ 2005 ؛ Galán et al. ، 2008).

سيتم حقن مائتي ميكرولتر من السم الخام المجفف بالتجميد في المخزن المؤقت المناسب بتركيز 25 مجم / مل في عمود Grace Vydac Reverse Phase C18 (4.6 x 250 mm). سيتم استخلاص الكسور باستخدام 0.1٪ حمض ثلاثي فلوروأسيتيك (TFA) ، و 80٪ أسيتونيتريل (ACN) في تدرج TFA بنسبة 0.1٪ على مدى 60 دقيقة بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. سيتم الكشف عن البروتينات عند 280 نانومتر. سيتم اختبار الكسور لتثبيط تراكم الصفائح الدموية الناجم عن ADP

سيتم تجزئة الكسور التي تم جمعها باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي C18 الذي يثبط تراكم الصفائح الدموية عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. سيتم حقن مائتي ميكرولتر من الكسور المجمعة في عمود Waters ™ ProteinPak 60 (7.8 × 300 مم) على نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء Waters ™. سيكون المخزن المؤقت المستخدم 0.02 M فوسفات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 6.2 ، أكثر من 60 دقيقة بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. سيتم الكشف عن البروتينات عند 280 نانومتر. سيتم اختبار الكسور لتثبيط تراكم الصفائح الدموية الناجم عن ADP.

سيتم تجزئة الكسور التي تم جمعها باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التي تمنع تراكم الصفائح الدموية عن طريق كروماتوغرافيا تبادل الأنيون. سيتم تطبيق مائتي ميكرولتر من الكسور المجمعة في عمود Waters PROTEIN-PAKTM 5PW (7.5 × 75 مم) على جهاز Waters HPLC. سيكون المخزن المؤقت المستخدم 0.02 M Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، مع محلول التصفية الذي يحتوي على 0.5 M NaCl ، أكثر من 60 دقيقة بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. سيتم الكشف عن البروتينات عند 280 نانومتر. سيتم اختبار الكسور لتثبيط تراكم الصفائح الدموية الناجم عن ADP ومقايسات disintegrin الأخرى بما في ذلك تثبيط هجرة الخلايا ، التصاق الخلية ، ورم خبيث ، وتكوين الأوعية.

الطريقة الأكثر فعالية لتحديد كتلة البروتينات والببتيدات هي قياس الطيف الكتلي. هذه طريقة شائعة مستخدمة في NNTRC (Khunsap et al.، 2011؛ ​​Sánchez et al.، 2010؛ Salazar et al.، 2009؛ Galán et al.، 2008).

سيتم تجفيف عينات البروتين في Eppendorf speedvac لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية ، وتعليقها في 10 لترات من 0.1٪ TFA / 50٪ ACN ، وتحليتها باستخدام C18 Zip Tip (Millipore ZTC18S096). سيتم رصد خمسمائة نانولتر من حمض cyano-4-hydroxycinnamic (Bruker Daltonics) على لوحة مستهدفة MTP AnchorChip 600/384 TF (Bruker Daltonics) وستتم إضافة 0.5 ميكرولتر من العينة إلى المصفوفة. سيتم إجراء تحليل MALDI-TOF باستخدام Bruker AUTOFLEX II-TOF (Bruker Daltonics) في الوضع الإيجابي. سيتم إجراء معيار الببتيد 2 (Bruker Daltonics) بما في ذلك الأنسولين 5735.89 و ubiquitin-8573.6 و cytochrom-12370.83 و myoglobin-16948.86 و cytochrome-6183.08 و myoglobin-8459.67 في وضع الانعكاس.

سيتطلب هذا المشروع البحثي فحص دم الإنسان بحثًا عن التفكك في سموم الثعابين التي تمنع تراكم الصفائح الدموية البشرية. سيُستخدم دم الإنسان أيضًا في ألواح أجار الدم للكشف عن إنزيم الفوسفوليباز. سيتم استخدام الدم فقط ككاشف ولن يتم الاحتفاظ بسجلات بشرية. ستكون جميع المواد المستخدمة في جمع الدم معقمة ومستخدمة لمرة واحدة.

قبل وبعد التنقية ، سيتم استخدام المقايسات البيولوجية لفحص أجزاء السم والسم من أجل الأنشطة النزفية والمحللة للبروتين ومحلل الفبرين والفيبرينوجينولتيك والجيلاتيناز. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم استخدام مقايسات التفكك بما في ذلك تلك التي تمنع ورم خبيث ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتجميع الصفائح الدموية. سيتم استخدام فحوصات أخرى لتحديد الوظائف البيولوجية للببتيدات التي تمنع ورم خبيث بشكل أفضل. يتم إجراء فحوصات تجميع الصفائح الدموية وفحوصات ربط الخلايا بشكل روتيني في NNTRC. سيتم فحص الجزيئات التي تظهر إمكانية الحد من الورم في الفئران BALB / ج.

سيتم إجراء فحص نزفي لتحديد السموم والكسور التي تسبب النزيف. نستخدم بشكل روتيني طريقة معدلة وصفها Sánchez et al. (2011) لتحديد الحد الأدنى من الجرعة النزفية (MHD) للسموم الخام. سيتم إجراء سلسلة من التخفيفات لكل عينة من السم ، منها 0.1 مل من كل تخفيف سيتم حقنه تحت الجلد في ظهور فئران BALB / c (ن = 8) لاختبار النشاط. بعد 24 ساعة ، سيتم التضحية بالفئران. سيتم قياس البقع النزفية (مم) وتحديد MHD. يتم تعريف MHD على أنه كمية بروتين السم الذي يسبب بقعة نزفية 10 مم. بعد الحصول على النتائج سيتم تغذية الفئران إلى الثعابين.

تم استخدام هذا الاختبار بشكل روتيني لتأكيد تنقية جزيئات الفبرين وفحص جميع السموم لأنشطة تحلل الفبرين (Sánchez et al. ، 2005).

ستتم إضافة ثلاثمائة ميكرولتر من محلول الفيبرينوجين (9.4 مجم / مل) و 10 ميكرولتر من محلول الثرومبين (38.5 وحدة / مل) إلى كل بئر من صفيحة 24 بئر ، والتي سيتم اهتزازها برفق بعد ذلك. سيتم السماح للمحلول الموجود في اللوحة بالتخثر في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم تحضين الصفيحة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. يتم إضافة عشرة ميكرولتر من جزء السم لكل بئر وتحضينها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. سيتم وضع سبعمائة ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) في كل بئر ، ثم سكبها بعد 10 دقائق. يتم حساب نشاط انحلال الفبرين المحدد بقسمة القطر المصفى (مم) على كمية عينة البروتين (ميكروغرام) الموضوعة في كل بئر.

يحتوي سم الأفعى على مزيج من آلاف السموم النشطة بيولوجيًا ، وكثير منها عبارة عن مكونات ذات نشاط إنزيمي. اختبار Hide Powder azure هو تقنية غير مكلفة وسريعة وسهلة لتحديد البروتياز.

طريقة معدلة من Rinderknecht وآخرون. (1968) لاختبار نشاط التحلل. يتم طحن المسحوق اللازوردي إخفاء بمدافع الهاون والمدقة للحصول على جزيئات موحدة قبل إضافة المادة المخففة. سيتم خلط ثمانية مليغرامات من مسحوق الجلد اللازوردي المطحون ناعماً مع 2 مل من 0.02 M من محلول Tris-HCl المؤقت ، ودرجة الحموضة 8.0 ، وسيتم بعد ذلك إضافة 100 ميكرولتر من كل جزء من السم إلى القارورة. سيتم تحضين كل قنينة لمدة ساعة واحدة عند 1 درجة مئوية ويقاس الامتصاص عند 37 نانومتر. سيتم حساب النشاط المحدد بقسمة الامتصاصية على كمية البروتين المستخدم (مجم).

يعتبر اختبار الجيلاتيناز مقايسة غير مكلفة وبسيطة وسريعة للبروتين والتي سيتم استخدامها في فحص السموم والكسور النقية والمنتجات المعبر عنها (كدنا). ستكون هذه الطريقة مفيدة في تحديد إنزيمات سيرين بروتياز وإنزيمات البروتين المعدني عند استخدامها في وجود مثبطات معينة من البروتياز.

سيتم استخدام طريقة معدلة من Huang and Pérez (1980) لاختبار نشاط الجيلاتينيز في كسور السم. سيتم وضع عشرين ميكرولتر من كل جزء من السم في مواقع منفصلة على فيلم التصوير العلمي Kodak X-OMAT مع طلاء الجيلاتين. سيتم تحديد التحلل المائي للجيلاتين على فيلم الأشعة السينية عن طريق غسل الفيلم بماء الصنبور بعد فترة حضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة.

لقد نشرنا البيانات التي تشير إلى أن هذه الأداة مفيدة في تحديد البروتينات التي لها أنشطة محفزة للتخثر ومضاد للتخثر ومضادة للصفائح الدموية (Sánchez et al. ، 2010 ؛ Suntravat et al. ، 2010). يمكن استخدام وظيفة الصفائح الدموية لفحص السموم بحثًا عن التفكك. سيتم استخدام اختبار تنشيط السرير الزجاجي (gbACT + KIT الذي تم الحصول عليه من Sienco، Inc) لمراقبة تأثير كسور السم على عملية التخثر. سيتم تحضين 37 في المائة من دم الإنسان المحتضن إلى 5 درجة مئوية قبل 13 دقائق على الأقل من الاستخدام. سيتم إضافة ما مجموعه 0.25 ميكرولتر من 2 M CaCl10 إلى جانب واحد من كفيت gbACT + KIT ثم يتم إضافة 0.85 ميكرولتر من التفكك بنفس التركيزات المولية أو 1٪ محلول ملحي (تحكم سلبي) إلى الجانب الآخر من الكوفيت. سيتم استخدام disisntegrin المؤتلف ، r-mojastin 2010 ، كعنصر تحكم إيجابي (Sánchez et al. 360). بعد إضافة كلا المحلين ، ستتم إضافة 3.1 ميكرولتر من الدم إلى الكوفيت وسيتم تنشيط المحلل. سيتم جمع البيانات بواسطة برنامج Signature Viewer ™ الإصدار XNUMX على كمبيوتر iMac يحتوي على برنامج Mac OS X.

يعد مقياس التجميع أداة مفيدة لتحديد تراكم مضادات الصفائح الدموية في الدم الكامل ، ولكنه قد يشير أيضًا إلى وجود المتفكّلات ، التي تمنع حدوث ورم خبيث. سيتم تأكيد الكسور الموجبة عن طريق فحوصات الالتصاق الخلوي.

سيتم استخدام مقياس تجميع لومي للدم الكامل كرونولوج ™ لمراقبة تثبيط تراكم الصفائح الدموية عن طريق قياس المعاوقة. سيتم تحضين أربعمائة وخمسين ميكرولتر من 10٪ من الدم البشري السيترى عند 37 درجة مئوية قبل 5 دقائق على الأقل من الاستخدام بكميات متساوية من محلول ملحي 0.15 م. سيتم تحضين عشرة ميكرولتر من جزء السم مع عينة الدم لمدة دقيقتين عند 2 درجة مئوية. سيبدأ تجميع الصفائح الدموية بمقدار 37 ميكرولتر من ADP (التركيز النهائي 10 ميكرومتر) ، وسيتم قياس النسبة المئوية للمقاومة التي تعكس النسبة المئوية للتجميع. سيتم حساب النسبة المئوية لتثبيط تراكم الصفائح الدموية بالمعادلة التالية: [(CE / C] x10 ، حيث C هي وحدات تجميع الصفائح الدموية (أوم) للتحكم ، و E هي وحدة تجميع الصفائح الدموية (أوم) للكسر التجريبي. وسيتكون التحكم السلبي من الدم الكامل المحتضن بـ 100 ميكرولتر من محلول ملحي بنسبة 10 ميكرولتر من محلول ملحي. Sánchez et al. 0.15). سيتم تقييم مدى تثبيط تراكم الصفائح الدموية عن طريق المقارنة مع الحد الأقصى للتجميع الناجم عن جرعة التحكم من ناهض (1 ميكرومتر ADP) والمُعبر عنها بتركيز تثبيط 2010٪ (IC10) على النحو المحدد من منحنى الاستجابة للجرعة المتولد من تركيزات المضاد المختلفة

هذا اختبار بسيط يستخدم بشكل روتيني لقياس نشاط عامل X المنشط.

سيتم اختبار نشاط عامل X المنشط في كسور السم أو السم باستخدام ركيزة كروموجينية خاصة بعامل Xa S-2765 كما وصفها Suntravat et al. (2011 ؛ 2010). سيتم تحضين خمسة وعشرين ميكرولترًا من البلازما البشرية الطبيعية المجمعة (50 مجم / مل) المذابة في محلول Tris-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، سيتم إضافة 25 ميكرولتر من الركيزة الكروموجينية S-2765 وخلطها في غضون 30 ثانية. ستتم إضافة 25 ميكرولتر من كسور السم أو السم المخلوطة مسبقًا بـ 0.1 M CaCl بكميات مكافئة واحتضانها عند 2 درجة مئوية لمدة 37 دقائق. سيتم إيقاف التفاعل بنسبة 3٪ حمض الأسيتيك. سيتم رصد العينات عند 20 نانومتر. تم إجراء كل اختبار في نسختين.

سنستفيد من موارد الثعابين الموجودة في NNTRC لبناء مكتبات (كدنا) باستخدام غدد السم. وقدرت أنه يمكن بناء مكتبتين (كدنا) في السنة. الأول سيكون من غدد سم ثعبان C. horridus. سيتم تشريح غدد الثعابين من الثعابين الموت الرحيم وتجميدها على الفور في النيتروجين السائل. تم تفصيل الإجراء الكامل لبناء مكتبة cDNA في منشورنا (Jia et al. ، 2008). سيتم استخدام حوالي 20 ميكروغرام من الغدة لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RNeasy Mini (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). سيتم إنشاء مكتبة cDNA اتجاهية باستخدام 0.5 ميكروغرام من إجمالي RNA باستخدام Creator SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech Laboratories ، Inc. ، Mountain View ، CA ، USA) بناءً على إرشادات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. أولاً ، سيتعرض إجمالي الحمض النووي الريبي (0.5 ميكروغرام) من غدد السم للنسخ العكسي وسيتم تصنيع cDNAs باستخدام PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) و CDSIII / 3 'PCR التمهيدي (Clontech) لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية. ثانيًا ، سيتم إجراء تخليق cDNA المزدوج (ds cDNA) على جهاز iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA) عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل لمسافات طويلة (LD). أخيرًا ، سيتم تجزئة ds (كدنا) المهضوم باستخدام عمود CHROMA SPIN-400 (Clontech). سيتم إرسال عينات من 3 ميكرولتر من كل جزء كهربائيًا على هلام agarose / EtBr بنسبة 1.1٪ لتحديد كسور الذروة من خلال تصور شدة العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. سيتم تجميع الكسور على أنها كدنا كبيرة ومتوسطة وصغيرة الحجم ، مركزة ومربوطة بشكل منفصل في ناقل pDNR-LIB (Clontech) طوال الليل عند 16 درجة مئوية. سيتم تحويل تفاعلات الربط الناتجة إلى طلقة واحدة Electrocomp GeneHogs E.coli (Invitrogen Corporation ، Carlsbad ، CA ، USA) بشكل منفصل. سيتم خلط المكتبات الثلاث (الكبيرة والمتوسطة والصغيرة الحجم) لمكتبة سم الثعبان الفريدة cDNA. يتم استخدام جميع الإجراءات بشكل روتيني في NNTRC (Jia et al. ، 2008 ؛ Sánchez et al. ، 2010 ؛ Suntravat et al. ، 2012 غير منشورة). سيتم إرسال الحيوانات المستنسخة (كدنا) إلى مرفق الحمض النووي بجامعة ولاية آيوا للتسلسل باستخدام محلل الحمض النووي التطبيقي 3730xl.

سيتم إجراء PCR لتضخيم الجين كامل الطول باستخدام نسخ cDNA كقوالب PCR. سيتم استخلاص منتجات PCR وترسيبها باستخدام الإيثانول في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. سيتم غسل الحبيبات في 1٪ من الإيثانول ، وتجفيفها ، ثم إذابتها في H70O واستنساخها جزئيًا في ناقل pGEX-2T-4 (GST) (Amersham Biosciences). سيتم تحويل جين GST إلى خلايا مختصة باللون الأزرق XL. سيتم استخلاص DNA البلازميد باستخدام مجموعة miniprep وتسلسلها لتأكيد التداخل داخل الإطار مع ناقل GST (جيا وآخرون ، 1 ؛ جيا وبيريز ، 2009).
سيتم تحويل البلازميد المؤكد ، جين GST إلى نجم سلالة الإشريكية القولونية BL21 لإعطاء سلالة جين BL21 / GST. ستتم تربية السلالة المؤتلفة أولاً في قوارير اهتزاز تحتوي على وسط Luria-Bertani (LB) بين عشية وضحاها. بعد زرع الثقافة بين عشية وضحاها في وسط LB جديد ، سيتم الحفاظ على نمو خلايا الثقافة عند 37 درجة مئوية ومراقبتها بشكل عكر عند 600 نانومتر على طول الدورة الزمنية. عند الوصول إلى OD 600 من 0.5 ، سيتم تحفيز الثقافة باستخدام 100 ميكرومتر من Isopropyl-D-thiogalactoside (IPTG) لمدة 3 ساعات لتحريض البروتين المؤتلف.

بعد الحضانة ، سيتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتعليقها في محلول ملحي 1 × فوسفات مخزنة (PBS). سيتم فصل الخلايا على الجليد باستخدام Branson Sonifier 450 (برانسون ، دانبري ، سي تي) مع ضبط التحكم في الإخراج عند 1 ، وإعداد دورة عمل ثابت ، و 6 نبضات صوتية من 30 ثانية لكل نبضة. سيتم طرد المحللة لمدة 15 دقيقة عند 10,000 جرام. سيتم تنقية تقارب المادة الطافية باستخدام حبات Glutathione-Sepharose 4B في عمود Econo-Column (BIO-RAD) على مضخة ECONO (BIO-RAD) بمعدل تدفق يبلغ 0.3 مل / دقيقة. سيتم بعد ذلك غسل العمود بـ 30 مل من محلول PBS بارد مثلج 1 × بمعدل تدفق يبلغ 0.3 مل / دقيقة. سيتم استخلاص بروتين الانصهار الجيني GST من الحبيبات بمقدار 10 ملي مولار من Glutathione Elute Buffer (GEB) أو سيتم قطع البروتينات المؤتلفة من بروتين GST باستخدام بروتين الثرومبين في العمود لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، ويتم التصفية منه بـ 2 x العازلة PBS. سيتم تمرير البروتين المُزال من خلال عمود HiTrap Benzamidine FF (GE Healthcare) لإزالة بروتياز الثرومبين. سيتم تحديد نقاوة البروتين المؤتلف بواسطة الرحلان الكهربائي SDS باستخدام NuPAGE 1-4٪ Gel (Invitrogen).

سيتم استخدام اختبار الالتصاق الخلوي في الموارد ومكونات البحث للبحث المقترح. يعتبر اختبار الالتصاق الخلوي طريقة فعالة وملائمة لفحص التفكك الذي يمنع ارتباط مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا بروابط مختلفة ، وبالتالي ، من الضروري اختبار مجموعة واسعة من خطوط الخلايا السرطانية التي تحتوي على إنتغرينات مختلفة. (Lucena et al.، 2012؛ Lucena et al.، 2011؛ ​​Sánchez et al.، 2009).

سيتم استخدام ما مجموعه 12 خطًا خلويًا في هذا الإجراء (خط خلايا سرطان المثانة البولية البشرية (T24) ، الساركوما الليفية البشرية (HT-1080) ، سرطان الجلد البشري (SK-Mel-28) ، سرطان القولون والمستقيم البشري (CaCo-2) ، سرطان الثدي البشري (MDA-MB-231) ، ورم سرطان الثدي البشري (سرطان الثدي) 1p) وسرطان الجلد الفأري (B66.3F16) وخطوط خلايا سرطان البنكرياس البشري BxPC10 و Panc3 و Capan1 و AsPC1. هذه كلها خطوط خلوية تم شراؤها وتخزينها في NNTRC. سيتم تقييم كسور السم من أجل ارتباطها المحدد عن طريق اختبار التصاق الخلية كما هو موضح بواسطة مصفوفة فيبريكس فيبريكس وآخرين (1). فيترونكتين ، كولاجين ، أو لامينين عند 2011 ميكروغرام / مل في 96 م PBS ، ودرجة الحموضة 10 ، وحضنت طوال الليل عند 0.01 درجات مئوية. سيتم حظر اللوحة بـ 7.4 مل من PBS في 4٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) وحضنتها عند 0.2 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ستُضاف الديسنترينات إلى المعلق الخلوي بتركيزات مختلفة ويُسمح لها بالاحتضان عند 5 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

سيتم استنشاق محلول الحجب ، وستتم إضافة معلقات الخلية / المتفكك (0.2 مل) إلى الآبار المغلفة ببروتين المصفوفة وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. سيتم شفط المحلول وغسله ثلاث مرات باستخدام PBS-1٪ BSA عن طريق الملء والسفط. سيتم إضافة ما مجموعه 5 مل من وسط MEM في 0.2٪ من مساحة سطح الجسم التي تحتوي على 1- [3،4,5-ثنائي ميثيل ثيازول -2-ييل] 2,5،5-ديفينلتيترازوليوم بروميد (MTT) (1: 37 مجلد / المجلد) إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا واحتضانها عند 2 درجة مئوية لمدة ساعتين. ستتم إضافة ما مجموعه 0.1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الآبار لاستيعاب الخلايا. ستهتز اللوحة برفق وستتم قراءة الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ بيكمان كولتر طراز AD 340.

سيتم استخدام اختبار ترحيل الخلية في الموارد ومكونات البحث للبحث المقترح. تشكل هجرة الخلايا السرطانية وغزوها إلى المصفوفة خارج الخلية الوعائية جزءًا رئيسيًا من ورم خبيث. سنقوم بتقييم تأثير الببتيدات المعزولة والمستنسخة على هجرة الخلايا باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المختلفة (Lucena et al. ، 2012 ؛ Lucena et al. ، 2011 ؛ Galán et al. ، 2008).

سيتم قياس هجرة الخلايا السرطانية بعد كشط الخلايا من قاع البئر كما وصفها جالان وآخرون (2008). يتم استخدام هذه التقنية بشكل روتيني في NNTRC. سيتم استخدام الإيكستاتين التجاري عند 2.7 ميكرومتر ، وهو عبارة عن ديسيلغرين يمنع انتقال الخلايا السرطانية ، كعنصر تحكم إيجابي. يمنع التحكم الإيجابي هجرة الخلايا السرطانية. يتكون التحكم السلبي من الخلايا السرطانية المحتضنة مع برنامج تلفزيوني ، مما يسمح بحدوث هجرة الخلايا. سيتم تحضين الخلايا في غرفة CO2 وإزالتها فقط من الحاضنة للصور المجهرية في أوقات 0 و 3 و 6 و 12 و 24 ساعة بعد حضانة التفكك. سيتم حساب النسبة المئوية للإغلاق بالمعادلة التالية: النسبة المئوية للإغلاق: [(CE) / C] × 100 ، حيث C هي وحدات مسافة حافة الخلية (مم) في وقت صفر للتحكم ، و E هي المسافة من حافة الخلية (مم) في وقت الحضانة النهائي للكسر. سيتم التعبير عن نتائج ترحيل الخلية على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (n = 3) ، وتحليلها باستخدام اختبار Anova أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Newman-Keuls للمقارنة المتعددة ، باستخدام برنامج Graph Pad Prism.

سيتم استخدام اختبار تكوين الأوعية في الجسم الحي في مكونات الموارد والبحث للبحث المقترح. لا يكفي غزو الخلايا السرطانية وحده لإنتاج النقائل. من أجل البقاء والانتشار ، تحتاج الخلايا السرطانية إلى إمداداتها الخاصة من المغذيات والأكسجين ؛ يتم تحقيق ذلك من خلال تكوين الأوعية الدموية للورم. أهمية تولد الأوعية في التسبب في السرطان تجعل من الضروري تحديد النشاط المضاد لتولد الأوعية في التفكك باستخدام مقايسة تكوين الأوعية في الجسم الحي (Lucena el at. ، 2012 غير منشورة).

سيتم إجراء اختبار سدادة matrigel بطريقة معدلة من Yeh et al. ، 2001. قسامة (0.5 مل) من matrigel ، مكملة بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) (500 نانوغرام / مل) في وجود أو عدم وجود التفكك ، سيتم حقنه تحت الجلد في المنطقة الظهرية من BALB / c الفئران. بعد 18 يومًا ، ستتم إزالة سدادات matrigel وتشريحها خالية من الأنسجة الملتصقة ووزنها وتجانسها لتقدير كمية الهيموغلوبين باتباع الطريقة اللونية التي وصفها Higuchi et al (20). سيتم تجانس قابس Matrigel في كاشف Drabkin سعة 15 مل (Sigma-Aldrich ، St Louis ، MO) وطرده عند 2011 جم لمدة 2.0 دقيقة. سيتم ترشيح المواد الطافية من خلال مرشح 10,000 ميكرومتر (Millipore ، Bedfor ، MA) وسيتم تحديد الهيموجلوبين في العينات بالطيف الضوئي عند 15 نانومتر. سيتم حساب كمية الهيموجلوبين بمعيار معروف. سيتم التعبير عن النتائج على أنها ميكروغرام Hb mg-0.22 من الأنسجة الرطبة.

سيتم استخدام اختبار استعمار الرئة في مكون البحث للبحث المقترح. اختبار مهم للتحقق من فعالية المتفكّلات كعوامل مضادة للسرطان هو تثبيط استعمار ورم الرئة في الجسم الحي. سيُستخدم هذا الاختبار لتحديد ما إذا كان من الممكن استخدام المتفكّلات لمنع ورم خبيث في الرئة في النماذج الحيوانية ولن يتم إجراؤه إلا باستخدام disisntegrins التي تُظهر نشاطًا إيجابيًا في فحوصات المختبر (Lucena el at. ، 2011 ؛ 2012).

سيتم إجراء استعمار الرئة للخلايا الورمية كما وصفها Lucena et al. 2011. خلايا سرطان الجلد المورين (B16F10) و / أو خلايا سرطان الثدي الثديية الفئران (66.3 بكسل) ، (5.0 × 106 خلية / مل) سيتم تعليقها في وسط إيجل Dulbecco المعدل أو MEM بدون FBS ، على التوالي ، في وجود أو عدم وجود التفكك عند 1000 ميكروغرام / كجم لكل فأر وحضانة ساعة واحدة عند 1 درجة مئوية. ستتألف الضوابط من الفئران المحقونة بخلايا أورام الفئران في الوسط دون FBS والفئران المحقونة بالمتوسط ​​وحده. سنستخدم ثمانية فئران في كل مجموعة. سيتم حقن مائتي ميكرولتر من خليط الخلايا / التفكك عن طريق الوريد (37) في الوريد الجانبي لفئران BALB / c (18-20 جم). سيتم التضحية بالفئران بعد 19 يومًا من الحقن ، وسيتم فحص الرئتين بحثًا عن وجود أورام. سيتم تصور الرئتين باستخدام 4 x مجسم مجسم. سيتم عد الأورام وتحليلها إحصائيا. سيتم استخدام اختبار t ثنائي الذيل متبوعًا باختبار Mann Whitney لتحديد أهمية المتفكّلات والتحكم في تثبيط عدد الأورام في الجسم الحي.

سيتم استخدام اختبار الفئران العارية في مكون البحث للبحث المقترح. الفئران العارية هي واحدة من أكثر النماذج المستخدمة على نطاق واسع لدراسة السرطان البشري. لتحديد إمكانات التفكك كعوامل مضادة للسرطان ، سنستخدم الفئران العارية ، وهي الفئران التي تعاني من نقص المناعة ولا ترفض الخلايا البشرية لإنشاء نموذج لانتشار سرطان البنكرياس البريتوني في الفئران. سيتم استخدام هذا الاختبار لفحص استجابة سرطان الإنسان ، وليس سرطان الفئران ، إلى التفكك.

سيتم استخدام أربعة خطوط من خلايا البنكرياس التي غزت بقوة الغشاء القاعدي الاصطناعي لدراسة النشاط المضاد للنقائل في الفئران العارية. سيتم تنفيذ البروتوكول عن طريق تعديل إجراء فوجيوارا وآخرون. (2011). سيتم خلط الخلايا مع التفكك بتركيزات مختلفة (ميكروغرام / كغ) واحتضانها لمدة ساعة عند 1 درجة مئوية. سيتم حقن الخليط داخل الصفاق (ip) في فئران BALB / c عارية (وزن 37-18 جم ؛ ن = 20 كل مجموعة). سيتم التضحية بالفئران بعد 8 يومًا من زرع الخلايا لتقييم النشاط المضاد للورم الخبيث في المتفكّلات. سيتم حساب عدد العقيدات البريتونية. سيتم قياس عدد ووزن العقيدات التي يزيد قطرها عن 24 مم. سيتم حقن مجموعة التحكم الإيجابية بخلايا حضنت ببرنامج تلفزيوني. سيتم حقن المجموعة الضابطة السلبية ببرنامج PBS وحده. ستتم الموافقة على جميع التجارب والإجراءات من قبل IACUC وسيتم إجراؤها وفقًا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني لرعاية الحيوان الصحية.